SANTRİFÜJLER klinikmuhendislik.com

biyomedikalmuhendislik.com klinikmuhendislik.com

SANTRİFÜJLER

Santrifüj; ağırlıkları önemli derecede farklı olan maddelerin yer çekimine bağlı olarak ayırımını hızlandıran bir araçtır. Santrifüj işleminde tüpte bulunan partiküller yoğunlukları ve büyüklüklerine göre farklı çökme hızlarına sahip olurlar. Çünkü çökme hızı; uygulanan kuvvete, partiküllerin şekline, yoğunluğuna ve ortamın yoğunluğuna bağlıdır.

KLİNİK LABORATUVARDA SANTRİFÜGASYONUN KULLANIMI:

1. Partikülleri süspanse oldukları solüsyondan ayırmada kullanılır. Bu uygulamanın örnekleri;

• Kandan hücrelerin ayırımı ve analizler için serbest serum veya

plazma sağlamak,

• Kimyasal analiz veya mikroskopik çalışma için biyolojik sıvıların hücresel elemanlarım ve diğer kısımlarını konsantre etmeyi sağlamak,

• Analiz edilecek numuneden kimyasal olarak presipite edilmiş proteinleri uzaklaştırmak,

• İmmunokimyasal ve diğer ölçümlerde, serbest ligantlardan protein bağlı veya antikor bağlı ligantları ayırmak.

2. Farklı yoğunluktaki iki likit fazı ayırmak için kullanılır. Bu uygulamanın örnekleri;

a)Plazma ve serumdan lipit bileşiklerini ayırmak,

b)Biyolojik sıvılardan organik çözücülere solitlerin ekstraksiyonunu sağlamak.

Santrifüjdeki bunca deneyime rağmen; kan numunelerinin santrifugasyonunda kullanılan RCF (rölatif santrifugal güç) ve süre için spesifik bir tavsiye yoktur. Ulusal Klinik Laboratuvar Standart Komitesi (NCCLS standart H18-P) 10 ± 5 dakika süreyle 1000-2000 x g RCF önermektedir. Ancak bu tavsiyeden bir hayli sapmalar da yeterli seperasyonu (ayrımlaşmayı) sağlamaktadır. Protein presipitatları içeren serum gibi numunelerin santrifüjü için saptanmış bir standart yoktur.

2. SANTRİFÜJÜN KOMPONENTLERİ:

Tüm santrifüjler bir rotor veya santrifüj kafesi, çevirme mili ve motordan oluşurlar. Rotor bir kapak ve mandalla hazırlanan bir odada bulunur. Çoğu santrifüjlerde açma düğmesi, zaman göstergesi, hız kontrolü, takometre ve fren vardır. Bazıları odadaki ısıyı ayarlamak için soğutucu ile donatılmıştır. Santrifüjler ayrıca rotorun dengesizliği gibi kötü fonksiyonları gösteren, görülebilir veya duyulabilir alarm sistemlerine de sahip olabilirler. Bazı santrifüj modellerinde rotor odasının üstünde veya her bir gödenin üzerinde santrifüj sırasında tüp kırılınca aerosol oluşumunu azaltmak için plastik bir kapak vardır.

Horizontal (yatay) başlıklı rotorun tipik olarak serbestçe sallanan 4 adet kovası vardır. Santrifüj işlemi sırasında tüp kırılmasını önlemek için tüp tutucularının çoğunda yastıkçıklar vardır. Çeşitli büyüklüklerdeki tüpler için uygun aplikatörler kullanılır.

Büyük bir santrifüjün sürücü motoru genellikle yüksek torklu (dönme momenti), direkt akımlı elektrik motorudur. Alternatif akım motorları genellikle küçük santrifüjlerde kullanılır. Rotor şaftı genellikle direkt veya bir dönme sistemi üzerinden yürütülür, ara sıra makara sistemi kullanılır. Santrifüjlerin çoğunda titreşimleri minimale indirmek ve yağlama ihtiyacını azaltmak için doldurulmuş ayak kullanılır. Motorun voltaj desteğini değiştiren bir potansiyometre ile santrifüj motorunun hızı ayarlanır. Potansiyometre ile rotor hızı ayarlansa da yük ağırlığındaki farklılıklar rotorun farklı hızda dönmesine neden olur. Takometre rotorun hızını, dakikada dönüş (rpm) olarak gösterir, çekim gücünü göstermez. Kutuplaşmış akımın motora geri dönmesi ile fren çalışır ve böylece yavaşlama sağlanır. Santrifüjdeki zaman ayarlayıcısı optimum koşullarda rotorun programlanmış hıza ulaşmasını ve frensiz olarak ayarlanan sürede yavaşlamasını sağlar.

Santrifüjde sürtünme sonucu ısı üretilir. Bu ısı, santrifüj edilen materyalin stabilitesini etkileyebilir ve buharlaşmasına neden olabilir. Santrifüj modellerinin çoğunda semm veya plazmayı ayırmak için tek bir dönüşten sonra ısı en çok 5 °C olabilir. Sıcaklıktaki değişme ortamın ilk ısısına, rotor hızına ve santrifüj süresine bağlıdır. Rotorun etrafındaki büyük oda ısıyı dağıtır. Santrifüj edilen materyal sıcaklıktan etkilenecekse soğutmalı santrifüj kullanılmalıdır.

3. SANTRİFÜJ TİPLERİ:

Santrifüjler ikiye ayrılır:

1. Manuel (el) santrifüjler

2. Otomatik (elektrikli) santrifüjler.

Manuel santrifüjler çok eskiden kullanılmış cihazlardır ve sadece tarihi önemleri vardır. Elektrikli santrifüjler dört çeşittir;

1. Masa tipi santrifüjler

2. Hematokrit santrifüjleri: Hematokrit ölçümü için kullanılırlar. Daha sonra tartışılacaktır.

3. Ultra santrifüjler: Sabit açılı rotorlar kullanan yüksek hızlı santrifüjlerdir. Klinik laboratuvarda ultrasantrifüjün en yaygın kullanımı lipoproteinlerin ayırımıdır. Ayrım saatler ve günler gerektirdiğinden ve önemli ölçüde ısı oluşturduğundan dolayı, ultrasantrifüj soğutulmuş bir oda gerektirir. Masa üstü model AirFuge ultrasântrifüj; yerçekiminin 165.000 katı kadar bir santrifüj gücü uygulayabilme kapasitesinde küçük rotoru olan minyatür bir hava türbünüdür. Klinik laboratuarda şilomikronlu serumu temizlemekte kullanılır, böylece infranatanla doğru analiz yapılabilir.

4. Soğutmalı santrifüjler: Santrifüj odası içindeki ısı kontrolü yapılabilir ve istenilen ısıda tutulabilir.

Santrifüjler Rotorlarına göre iki tiptirler:

1. Horizontal başlık (açıhmlı başlık; sallanan kova)

2. Sabit açılı başlık (açılımsız başlık; açılı başlık)

1. Horizontal başlık: Rotor hareket halindeyken horizontal (yatay) pozisyonda, dinlenme halindeyken vertikal (dikey) pozisyondadır. Santrifüj işlemi sırasında tüp santrifüj şaftına dik açıda iken, partiküller tüp boyunca sabit bir şekilde hareket ederler. Böylece çökelti tüpün dibinde düzenli bir şekilde toplanır. Çökeltinin yüzeyi düzdür (santrifüjün şaftına paraleldir), rotor durduğunda üzerinde sıvı bir kolon kalır.

2. Sabit açılı başlıkta: Tüpler rotasyonun vertikal aksına 25-40° açıda fıkse (sabit) halde tutulur. Partiküller horizontal başlıklı santrifüjde olduğu gibi tüpün kenarına çarpmadan horizontal olarak hareket ederler. Böylece tüpün dibinde ve kenarında çökelti toplanır. Sedimentin düzeyi santrifüj şaftına paraleldir. Rotor yavaşlayıp dururken çekim, sedimentin tüpün dibine doğru kaymasına neden olabilir. Bu tip santrifüjlerde genellikle zayıf toparlanmış bir çökelti oluşur.

Sabit açılı bir rotorun biçimi genellikle küçük partiküllerin sedimentasyonunun horizontal başlıklı rotordan daha hızlı olmasını sağlar. Sabit açılı rotorlar rotasyona bir hayli dirençlidirler ve hava sürtünmesi sonucunda ısı oluşturan horizontal başlıklı rotorlardan daha fazla hıza ulaşabilirler.

Büyük partiküllerin sedimentasyonu düşük hızda mümkündür. Horizontal başlıklı rotor; protein prensipitatlı süpernatandan veya plazmadan eritrositlerin ayrımı için yeterlidir.



4. SANTRİFÜJ PRENSİBİ:

Santrifüj prensibi; santrifüj alanında partiküllerin davranışına dayanır. Santrifüj çalıştırıldığında tüpte bulunan partiküller yoğunlukları ve büyüklüklerine göre farklı çökme hızlarına sahip olacaklardır. Çünkü çökme hızı uygulanan çökme kuvvetine, partikülün şekline, yoğunluğuna ve ortamın yoğunluğuna bağlıdır.

Santrifüj alanı (merkezkaç kuvvet; g); şafta dik olarak dışa doğrudur ve kuvveti açısal hızın karesi ve başlık yarıçapı ile doğru orantılıdır.

g = W2 r

g: Santrifüj alanı W: açısal hız (radyan/sn) r: yarıçap (cm)

Dakikadaki dönüş sayısı (rpm: rotatory per minute) olarak söylenen santrifüj hızı, bir santrifüjde iki fazın ayrılması için gerekli gücü tanımlamaz. Rölatif santrifüj alanı olarak da söylenen rölatif santrifüj kuvveti (RCF: Relative centrifugal force) daha doğru bir terimdir. Ünitesi; yerçekiminin 5000 x g gibi daha büyük bir katı kadar bir sayı ile ifade edilir.

Maksimum rölatif santrifüj gücü (RCF) şöyle hesaplanır: RCF(g)= 1,118 . 10-5.r.n2

1,118 . 10-5 : deneysel bir faktördür,

r : yarıçap (cm), santrifüj sırasında rotor kavitesinde dönme merkezinden tüpün dibine kadar olan horizontal mesafe,

n: rotorun dakikadaki dönme hızı (rpm).

Uygulanan rpm'de santrifüjle sağlanan RCF Dole ve Cotzias adlı İki araştırıcının geliştirdiği nomogramdan da saptanabilir. Bu nomogramda bir cetvel kullanarak elimizdeki başlığın yarıçapı ile motor hızı aynı hizaya getirildiğinde, ortadaki RCF çizgisini kestiği noktadaki değer; o hızla elde edilen rölatif santrifüj alanını verir.

Tüp rotor merkezinde belli bir açıda veya horizontal olsa bile, rotor merkezinden tüpün dibine kadar olan mesafeden RCF çıkartılabilir. Minimum RCF de aynı şekilde rotor merkezinden sıvı yüzeyine olan uzaklıktan hesaplanır ve maksimum RCF den birkaç yüz ‘g’ daha az olabilir.

Sabit açılı başlıklı rotorda, bir tüpe uygulanan RCF, horizontal başlıklı rotorunkinden çok daha az olabilir. Çünkü efektif yarıçapı azaltan faktör olan tüpün dışa doğru sallanması yetersizdir.

Aşağıdaki formül; orijinal olarak tanımlanmış RCF’den yarıçapı farklı olan başka bir rotorun gerektirdiği hızı hesaplamakta faydalanılır.

RCF (orijinal rotor)

Rpm (alternatif rotor) = 1000 ×

1.18 × r (cm; alternatif rotor)

Partiküllerin çökelmesi için gerekli olan zaman, rotor hızına, rotorun yarıçapına ve tüpteki partiküllerin çökerek kat ettikleri yol uzunluğuna bağlıdır. Santrifüj için gerekli olan zaman süresi de hesaplanabilir. Öyle ki farklı büyüklükteki alternatif rotor ile santrifüj, orjinale eşdeğer bir RCF sağlar.

Zaman × RCF (orijinal rotor)

Zaman (alternatif rotor)=

RCF (alternatif rotor)

Belli bir başlık hızında bir grup küresel cismin çökmesi için gerekli süre; başlığın yarıçapının karesi, partikülün yoğunluğu ve ortamın yoğunluğunun farkı ile ters, ortam viskozitesi ile doğru orantılıdır.

Ortam viskozitesi

Zaman =

r 2 × (partikül yoğunluğu – ortam yoğunluğu)

Bu durumda, yoğunlukları ve büyüklükleri birbirinden farklı olan heterojen bir karışım santrifüjlendiğinde yoğunlukları ve büyüklükleri aynı olan molekül grupları birlikte çökerler. Sonuç olarak yoğunluk ve büyüklükleri büyük olandan küçük olana doğru bir çökme sırası izlenir. Bu özellik doku homojenatlarından organellerin ayrılmasının temelini oluşturur. Bir doku homojenatında sırasıyla parçalanmamış hücre, hücre zarı, çekirdek, mitokondri, lizozomlar, mikrozomlar ve en son ribozomlar çöker.

Birçok değişik santrifüjleme teknikleri olmasına rağmen temelde amaca göre İki tür santrifüjleme işlemi vardır:

1. Preperatif santrifüjleme;

• Diferansiyel santrifügasyon,

• Hız-zonel santrifügasyon,

• Eşit yoğunluk santrifüjlemesi,

• Denge-izodansite santrifügasyonu,

2. Analitik Santrifüjleme

1. Preperatif santrifüjleme: Üzerinde çalışılacak biyolojik maddelerin izolasyonunu sağlar ve bu teknikte çok miktarda materyal işlenebilir. Örneğin; bakteri hücrelerinin toplanması, kan hücrelerinin ayrılması, mitokondrilerin elde edilmesi gibi. Preperatif santrifüjleme aynı zamanda protein, DNA gibi üzerinde yapı, kompozisyon ve biyolojik aktivite çalışılacak moleküllerin elde edilmesinde sık sık kullanılan bir yöntemdir. Preperatif santrifugasyonun alt grupları şunlardır:

a. Diferansiyel santrifügasyon: Bu tür santrifüjlemede, santrifüjleme alanının gücü arttırılarak bir doku homojenatmda organeller izole edilebilir. Burada her organel elde edildiğinde saf olmayabilir. Bu durumda uygun bir tamponla yıkanarak organeller antılabilir. Bu yöntem ribozomal alt birimlerin, RNA DNA hibritlerinin ve hücre organellerinin ayrımı için kullanılır.

b. Hız-zonal santrifügasyon: Bu uygulamada santrifüj tüpü üst kısmından dibine doğru gittikçe derişimi artan bir çözelti içerir. Bu çözelti CsCl ve sükroz olabilir. Bu çözelti üzerine uygulanan örnekte bulunan moleküller, uzun bir süre (18-20 saat gibi) santrifüjlemedcn sonra yoğunluklarına eşit yoğunluktaki çözelti kuşağında birikirler (Şekil 5.4).



Şekil 5.4

c) Eşit yoğunluk santrifüjlemesi: Bu santrifüjleme yönteminde; ayrılacak madde ile yoğunluğu aynı olan bir ortam kullanılır. Numune bu ortam ile karıştırılır ve uzun süre santrifüjlenir. Ortamdan daha yoğun olan maddeler tüpün dibinde, hafif olanlarda üstte toplanır. Ayrılması istenilen madde orta kuşakta toplanır. Daha sonra maddenin toplandığı ortamın yoğunluğu seyreltme ile azaltılarak ikinci bir santirüjleme yapılırsa, madde tüpün dibinde toplanır (Şekil 5.5).



Şekil 5.5

d) Denge izodansite santrifügasyonu: Denge izodansite santrifujgasyonunda ağır metallerin tuzları (sezyum, rubidyum) ile sükroz kullanılır. Örneğin; DNA numunesi homojen olarak derişik CsCl çözeltisi ile karıştırılır ve santrifüjlenir. Santrifüjleme sırasında bu ağır tuzlar çökerken bir dansite gradienti oluştururlar ve bu gradiente göre DNA molekülleri yoğunluklarına eşit yoğunlukta gradient kuşağına ulaşana kadar çökerler. Bu yöntem E.koli replikasyonun aydınlatılmasında ve insan plazma lipoproteinlerinin ayrılmasında kullanılmıştır.

2. Analitik Santrifüjleme:

Analitik santrifüjleme; saf veya saf kabul edilen moleküllerin veya partiküllerin (ribozom gibi) çalışılmasında kullanılır. Gereken madde miktarı çok küçüktür, bir optik sistem yardımı İle santrifüj alanındaki molekülün davranışı takip edilir ve fotoğrafla kaydedilir. Analitik santrifüjleme analiz edilen molekülün saflığı, molekül ağırlığı ve şekli hakkında fikir verir.

5.SANTRİFÜJ KULLANIMI:

İşlem sırasında yalnızca santrifüj yapılmasına uygun olan, üreticisi tarafından tavsiye edilen tüpler kullanılır. Propilen tüpler genellikle 5000 x g üzerindeki RCF'ye dayanabilirler. Tüpler dibine doğru gittikçe incelen bir yapıda olmalıdır ve büyüklükleri santrifüj godelerinin parmaklıklarına sıkıca oturacak kadar uygun olmalıdır. Tüpün üst kısmı godelerin üzerinde çok fazla bir çıkıntı yapmamalıdır.

Santrifüj işlemini kolaylaştırmak için rotor uygun bir şekilde dengelenmiş olmalıdır. Parmaklıkların, tüplerin ve içeriklerinin ağırlığı; rotorun karşı tarafının ağırlığından %1 veya cihazın üreticisinin saptadığı makul bir limitten daha çok farklı olmamalıdır. Farkın az olması santrifüj işlemini kolaylaştırır. Tüplerin yerleşimi karşı tarafın ağırlığı ile eşit ve simetrik olmalıdır. Her bir parmaklığın toplam ağırlığı hız limitini etkilediğinden, cihaz üreticisinin belirttiği limiti aşmamalıdır. Rotorun dengesizliği titreşime neden olur. Bu da tüplerin daha sık kırılmasına ve cihazın aşınmasına yol açar. Rotor yavaş hızda İken; yavaşladığı ya da hızlandığı anda normal olarak önemsiz bir titreşim beklenir. Hızlanma veya yavaşlama sırasında hızın kritik bir noktasında titreşim artabilir. Bu kritik noktada santrifüj işlemine devam edilmemelidir.

Santrifüj sırasında muhtemel bir aeresol oluşumunu azaltmak için kan tüplerinin ağzı tıkaçla kapatılarak santrifüj edilmelidir. Eğer tıkaç çıkarıldıktan sonra numune tekrar santrifüj edilmeyi gerektirirse tüp parafilm ile kapatılmalıdır.

Santrifüj işleminden sonra rotor tamamen durana dek santrifüjün kapağı açılmamalıdır.